近日，中国农业科学院作物科学研究所作物转基因及基因编辑技术与应用创新团队融合利用水稻密码子优化的nCas9 （H840A）蛋白和逆转录酶突变体，开发了一种高效的植物引导编辑系统，成功精准编辑了水稻的外源 hptII 突变基因和内源 OsEPSPS 基因，获得了精准编辑纯合和杂合植株，拓展了植物基因组精准编辑工具。相关研究成果于2020年3月25日在线发表于《分子植物（Molecular Plant）》杂志上。

　　近年来，CRISPR/Cas介导的植物基因组定点编辑、单碱基替换和同源重组体系的建立和利用，在农作物基因功能研究和精准育种中发挥了重要作用，展现了广阔的发展潜力和应用前景。然而，CRISPR/Cas介导的植物基因组定点敲除技术只能在基因组特定位点产生随机插入和删除。由CRISPR/Cas系统衍生的胞嘧啶和腺嘌呤碱基编辑器，只能在基因组靶向位点实现C→T，G→A，A→G和T→C等4种单碱基转换，还不能实现其它类型的碱基颠换。通过同源定向修复技术，进行基因组精确编辑，在植物中的效率依然非常低，只在少数实验室可行。因此，迫切需要建立更高效的植物基因组精准编辑技术体系。

　　此前，有研究通过将Cas9缺刻酶nCas9与逆转录酶突变体融合，在哺乳动物中开发了一系列新的基因组精准编辑体系-引导编辑系统。该系统能够在不存在DNA双链断裂缺口和DNA供体修复模板的情况下，实现靶向插入、删除和所有类型的单碱基自由转换和颠换，为提高作物精确编辑效率提供了可能。

　　基于动物引导编辑系统，作物转基因及基因编辑技术与应用创新团队进一步优化该系统，构建了高效植物引导编辑体系。将水稻密码子优化的逆转录酶突变体融合在具有双核定位信号的nCas9蛋白的C末端，使用玉米增强型启动子Ubiquitin启动子驱动该融合基因表达，并添加了具有增强mRNA稳定性的多聚腺苷酸（PolyA）结构和豌豆Rubisco小亚基E9终止子终止转录和翻译；进一步，使用水稻组成型Actin启动子驱动引导编辑向导RNA（pegRNA）和小向导RNA（sgRNA）的共表达，采用体内可自我剪切的tRNA间隔，同时添加了PolyA结构和Nos终止子以增强转录本的稳定性和提高表达量，构建了高效的植物引导编辑系统。研究人员利用上述植物引导编辑系统，分别对靶向水稻外源 hptII 突变基因和内源 OsEPSPS 基因进行精准基因编辑，成功获得了15株 hptII 精准修饰纯合植株和1株 OsEPSPS 基因精准修饰杂合植株，精确编辑效率分别为9.38%和2.22%。高效植物引导编辑系统的建立，为水稻以及其他作物基因组精确编辑提供了有效工具，有望大大促进农作物定向遗传改良的进程。

　　图：植物引导编辑系统对外源 hptII 突变基因和内源EPSPS基因的精准编辑

　　作科所博士研究生李慧园，李晶莹和博士后陈继林为本文共同第一作者，夏兰琴研究员为本文通讯作者。本研究得到转基因重大专项和中国农科院创新工程与“农科英才”特支计划项目资助。

　　文章链接：https://doi.org/10.1016/j.molp.2020.03.011